细菌内毒素检查法是利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。检测方法一般有凝胶法和光度测定法。

　　（1）GB/T 14233.2-2005 医用输液、输血js金沙老品牌、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法 [1]；

　　（5）鲎试剂。是从鲎的血液中提取出的冻干试剂，可以与细菌内毒素发生凝集反应。

　　（7）细菌内毒素检查用水应符合《中国药典》规定的灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/mL（用于凝胶法）或0.005 EU/mL（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。

　　（8）实验所用器皿：需经处理，去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃，至少30分钟）去除，若使用塑料器具，如加样吸头等应置30%双氧水中浸泡4h，再用细菌内毒素检查用水充分冲洗后置60℃烘干备用。也可以选择标明无热原的商业产品。

　　（9）试验常用材料器具：剪刀、砂轮、废品缸（收集碎玻璃）、无热原试管（10 mm×75 mm）、匹配的试管架、封口膜、酒精棉球、时钟、移液器及无热原吸头。

　　当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

　　目的为考察鲎试剂的灵敏度是否准确，同时也考查检验人员操作方法是否正确及试验条件是否符合规定。

　　（1）对未知或可疑的供试品初次进行细菌内毒素试验之前应先进行干扰试验，目的是检验供试品对细菌内毒素试验是否有抑制或增强作用，以及其他影响细菌内毒素试验准确性和敏感性的干扰作用。

　　（2）当鲎试剂、供试品来源、供试品配方或生产工艺有变化或其他任何可能影响细菌内毒素试验结果的试验条件改变时，应重新进行干扰试验。

　　（3）每种医疗器械产品应取3批，并分别使用不少于两个制造商生产的鲎试剂进行干扰试验。

　　（1）确认所需试验的试剂：鲎试剂、细菌内毒素工作标准品、细菌内毒素检查用水

　　（2）供试液的制备：供试品应使用细菌内毒素检查用水为浸提介质。根据本单位产品标准规定的细菌内毒素限值确定浸提介质的体积。

　　根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟或参照标准品说明书中要求的混匀时间进行操作，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒或参照标准品说明书中要求的混匀时间进行操作。取不同浓度的内毒素标准溶液，分别与等体积（如0.1mL）的鲎试剂溶液混合，每一个内毒素浓度平行做4管；另外取2管加入等体积的细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。

　　将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动，造成假阴性结果。

　　当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。

　　式中X 为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度；

　　当λc在0.5～2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。

　　a、应开展干扰试验预实验，确定供试品的最小不干扰稀释倍数；采用多个不同稀释倍数的供试品溶液，如某医疗器械产品限值为20EU/件，鲎试剂灵敏度为0.25EU/mL,按MVD=L/λ，【20EU/件÷0.25EU/mL=80】，则其最大有效稀释倍数为80mL/件。

　　按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数(MVD)的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

　　只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，试验方为有效。当系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。其他情况则认为供试品在该浓度下存在干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。

　　可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法(如过滤、中和、透析或加热处理等)排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。

　　按表2制备溶液A、B、C和D。使用稀释倍数不超过MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

　　若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。

　　若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。复试时溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品符合规定，否则判定供试品不符合规定。

　　若供试品的稀释倍数小于MVD而溶液A结果出现不符合规定时，可将供试品稀释至MVD重新实验，再对结果进行判断。

　　8.医疗器械细菌内毒素检测供试液制备推荐方法：GB/T 14233.2-2005

　　（1）管类和容器类器具用细菌内毒素检查用水浸泡器具内腔，在37℃±1℃恒温箱中浸提不少于1h；

　　（2）小型配件或实体类器具置无热原玻璃器皿内，加入细菌内毒素检查用水振摇数次，在37℃±1℃恒温箱中浸提不少于1h；

　　（3）采用无热原氢氧化钠或盐酸溶液调节供试液pH值在6.0~8.0范围内；

　　10.产品细菌内毒素方法的建立：《中国药典》9251 细菌内毒素检查法应用指导原则

　　（1）产品的细菌内毒素限值一般是通过公式L=K/M计算得到的。其中M为人用每千克体重每小时最大供试品剂量，可参考药品说明书或具有权威性资料的用法用量。制定品种细菌内毒素限值时，应考虑以下情况。

　　（2）联合用药应考虑其他制剂可能引入的细菌内毒素；儿科用药、营养不良用药和恶病质用药等，应考虑细菌内毒素对体弱患者人群可能导致更严重的影响。因此，制定上述品种细菌内毒素限值时，可在计算值的基础上适当严格。100ml及以上装量的大输液类制剂，其细菌内毒素限值一般不得超过0.50EU/ml。制定具有多种规格注射液的细菌内毒素限值时，限值的单位应与产品临床用法用量（M）的标示单位一致，如EU/mg、EU/U或EU/ml。制定原料药的细菌内毒素限值时，应参考其制剂的细菌内毒素限值。

　　（3）输液、输血、注射器具细菌内毒素限值在产品标准中规定，宜尽可能低。推荐限量每件不超过20EU，与脑脊液接触和胸内应用医疗器械每件不超过2.15EU。

　　（1）试验操作应在清洁环境中进行，过程中应防止内毒素的污染。在使用移液器取样时，应注意不要将移液器中的气体吹入溶液中。

　　（3）开启细菌内毒素国家标准品或工作标准品、鲎试剂时，先轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，蓝点向外，75%酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃碎片落入瓶内。

　　（4）医疗器械生产企业在生产过程中应严格控制产品初始污染菌，以免导致灭菌后产品细菌内毒素指标超过限值。

　　（5）对于非液态产品企业制定产品技术要求时，如按EU/ml规定细菌内毒素限值在试验方法中则需明确产品的浸提液体积。一般推荐按EU/件规定细菌内毒素限值。

　　（6）溶解鲎试剂及混匀供试品和鲎试剂时，试验过程中应注意更换吸头，以避免检查用水的污染及溶液的交叉污染。

　　（7）由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程中及观察结果时应注意不要使试管受到振动，使凝胶破碎产生假阴性结果。

　　（8）进行干扰试验时，标准对照系列和含内毒素的供试品溶液系列应同时进行；如经检验证实供试品对细菌内毒素试验有不能排除的干扰作用则不适宜采用凝胶限度法。

　　（9）在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰试验和供试品细菌内毒素检查时，各个试验中要求的对照应同时进行，并在试验有效的情况才能进行计算和判断。

　　（10）对于一个初包装内有多组件的成套器械，如规定的内毒素限值是针对成套器械的，可以用一份浸提液对所有组件浸提，也可将各组件分别浸提后混合，各组件所用的浸提液总体积应不超过MVD，当组合后样品出现结果不确定时，则需分别检验各组件，以研究各组件的污染源。

　　（11）如一个初包装产品为多个医疗产品的集合，在临床应用中每种医疗器械独立使用，则应有各自的产品内毒素限值，且应分别进行试验和评价。

　　（12）2020版《中国药典》1143细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度测定法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。